近幾十年來(lái)， 大腸桿菌是基因工程、 代謝工程和合成生物學(xué)等領(lǐng)域的重要工具菌株，是生產(chǎn)重組蛋白、氨基酸、有機(jī)酸、能源物質(zhì)和一些重要化工產(chǎn)品的主力微生物之一。為使大腸桿菌獲得新的性狀和生產(chǎn)能力， 基因敲除及基因敲入是構(gòu)建新型大腸桿菌的重要手段。

目前，一種基于 λ噬菌體的Red同源重組系統(tǒng)是大腸桿菌等原核生物基因組修飾的主要方法，是遺傳育種的有力手段。傳統(tǒng)的Red同源重組方法主要是先用兩端帶同源臂的抗生素基因片段或帶有目的基因和抗生素基因片段替換特異的大腸桿菌基因組基因，再把抗生素基因片段通過(guò)重組酶（ flippase，FLPｆ） 同源重組去除。但經(jīng)過(guò)這種敲除后的基因組中還殘留一個(gè)FRT序列的疤痕， 殘留的疤痕限制了再次利用該敲除系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步基因組改造。因此， 一種不留下疤痕的敲除方法已成為近期研究的熱點(diǎn)。

近期來(lái)自大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院等處的研究人員以無(wú)痕敲除大腸桿菌 CLM37基因組nanKETA基因?yàn)槟Ｐ停?/span> 通過(guò)優(yōu)化同源雙鏈核苷酸的長(zhǎng)度和誘導(dǎo)表達(dá)篩選酶的誘導(dǎo)濃度， 建立了快速高效無(wú)痕基因敲除體系，為大腸桿菌基因組改造提供了有效方法。這一研究成果公布在《中國(guó)生物工程雜志》上。

現(xiàn)階段， 適用于大腸桿菌的無(wú)痕敲除方法主要有Red同源重組系統(tǒng)與核酸內(nèi)切酶I-SceI切割篩選相結(jié)合法， 兩步Red同源重組系統(tǒng)正負(fù)篩選法， Tn5靶向的Cre/loxP切除系統(tǒng)法等。但目前的無(wú)痕敲除方法普遍存在如操作步驟較復(fù)雜、 周期較長(zhǎng)、 重組率較低等不足。最常用的方法是基于Red同源重組系統(tǒng)和核酸內(nèi)切酶I-SceI的切割篩選作用， 其原理主要通過(guò)兩步連續(xù)的同源重組實(shí)現(xiàn)無(wú)痕敲除， 即先用帶篩選標(biāo)記的抗性基因和核酸內(nèi)切酶I-SceI識(shí)別序列的片段敲除目的基因片段； 再通過(guò)完全與目的基因上下游同源的片段同源重組， 依靠誘導(dǎo)核酸內(nèi)切酶I-SceI表達(dá)， 切割篩選去除未進(jìn)行重組的菌株， 達(dá)到無(wú)痕敲除目的。但在第二步同源重組時(shí)效率較低， 即無(wú)痕化處理效率較低，是該技術(shù)的主要瓶頸。

在這篇文章中，研究人員以無(wú)痕敲除大腸桿菌nanKETA基因簇為模型，利用Red同源重組系統(tǒng)和核酸內(nèi)切酶I-SceI的篩選作用，通過(guò)兩步連續(xù)同源重組無(wú)痕敲除大腸桿菌CLM37基因組中的nanKETA基因，優(yōu)化無(wú)痕敲除時(shí)同源DNA長(zhǎng)度與誘導(dǎo)用于篩選陽(yáng)性克隆I-SceI表達(dá)的誘導(dǎo)劑濃度。

通過(guò)比較敲除nanKETA基因前后菌株的生長(zhǎng)曲線，研究大腸桿菌CLM37缺失nanKETA基因后的生長(zhǎng)狀態(tài)。結(jié)果研究人員成功無(wú)痕敲除大腸桿菌CLM37基因組中的nanKETA基因，并在無(wú)痕化處理時(shí)，通過(guò)延長(zhǎng)與基因組同源DNA的長(zhǎng)度，由通常使用的80堿基對(duì)延長(zhǎng)到684堿基對(duì)；并通過(guò)提高誘導(dǎo)篩選基因表達(dá)的四環(huán)素的濃度，由500 μg/ml提高到1000 μg/ml后，使無(wú)痕敲除效率高達(dá)90%以上。生長(zhǎng)曲線研究表明，缺失nanKETA基因后的菌株生長(zhǎng)狀態(tài)與原菌株基本一致。

由此研究人員認(rèn)為通過(guò)延長(zhǎng)與基因組同源的雙鏈核苷酸的長(zhǎng)度和誘導(dǎo)篩選基因表達(dá)的四環(huán)素的濃度，可顯著提高無(wú)痕敲除的效率。

研究人員指出，通過(guò)適當(dāng)延長(zhǎng)無(wú)痕化處理時(shí)使用的雙鏈核苷酸的長(zhǎng)度和提高誘導(dǎo)篩選基因表達(dá)的四環(huán)素的濃度， 不僅能使得到的重組菌不攜帶任何抗性篩選標(biāo)記，達(dá)到大腸桿菌染色體基因無(wú)痕敲除的目的， 還使無(wú)痕化處理效率達(dá)到 90 ％以上， 顯著提高了無(wú)痕敲除的效率， 縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間， 為構(gòu)建特異基因型微生物和微生物代謝途徑改造的研究提供了一個(gè)非常有效的手段。

敲除大腸桿菌中的nanKETA基因， 能提高唾液酸合成效率， 有利于提高唾液酸的產(chǎn)量。唾液酸是一類9碳單糖的衍生物， 在許多生物、 病理和免疫識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用， 如細(xì)胞粘附、 抗感染、 抗病毒、 腫瘤轉(zhuǎn)移等。這一研究利用 λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)， 成功對(duì)大腸桿菌CLM37基因組中nanKETA基因進(jìn)行無(wú)痕敲除， 得到nanKETA基因缺失的菌株， 為進(jìn)一步高效生產(chǎn)唾液酸及唾液酸修飾寡糖的研究奠定了基礎(chǔ)。