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抗體的鑒定

日期:2010-08-09 14:23:05


        篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養而獲得雜交細胞系中,僅少數能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時,即可開始檢測特異性抗體,篩選出所需要的雜交瘤細胞系。
 
   檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同,選擇不同的篩選方法,一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
  常用的方法有:
  1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白質)、細胞和病毒等McAb的檢測。
  2. RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。
  3. FACS(熒光激活細胞分類儀)用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。
  4. IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。

可靠的篩選方法必須在融合前建立,避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。

1.抗體效價的鑒定
  根據抗原性質的不同,抗體效價的測定方法不同。一般可溶性抗原可采用雙向瓊脂擴散的方法,顆粒性抗原可采用凝集實驗的方法。
  在標記免疫分析中,所用的抗體最終稀釋度稱為抗體的工作濃度,抗體在應用前應進行效價測定。在放射免疫分析中,抗體的滴度(titer)有其特定的定義,是指結合50%標記抗原時抗血清的稀釋度。
  抗體的滴度以在反應液中的稀釋度表示。在實際工作中抗體的量可明顯的影響試驗的靈敏度和準確性。抗體過多可使試驗的靈敏度下降,而抗體過少時試驗的靈敏度雖高但重復性和準確度較差。為選擇適當的抗體稀釋度,可用連續稀釋法確定(圖4 -1)。將抗血清用加倍稀釋法配成不同稀釋度的溶液,然后分別加一定量的標記抗原,共同溫育后分離結合的標記抗原抗體復合物和未結合的標記抗原。當B / F = 1,即B / T = 50%時的抗體稀釋度即為最佳的稀釋度。如只測量結合部分(B),而且以B / B0 為縱坐標,以劑量為橫坐標作劑量反應曲線,則B / T = 30%~50%時抗體的稀釋倍數即為最佳的抗體稀釋度。抗體(抗血清)的最佳稀釋度(即抗體的滴度)越高,表明抗體的質量越好。
  2. 體特異性鑒定
  抗體的特異性鑒定一般采用相似的抗原與待鑒定抗體反應。如果出現交叉反應,說明有交叉抗體的存在。此時,可用相應抗原吸收,以提高抗體的特異性。
  1)抗體特異性的表示方法及其計算:抗體的特異性以交叉反應率表示,其計算方法如下:交叉反應率 = [待測抗原50%結合時的濃度] / [待鑒定類似物50%結合時的濃度]·100%
  應該注意的是,交叉反應曲線的橫坐標應以物質的分子濃度(mol / L)表示。因為抗原-抗體反應應服從于質量作用定律,它們的結合不論是單價的還是多價的,都只能與分子數有關,即都以分子數為基礎。因此,反應物和產物都應以分子濃度表示。Miller和Vaides比較了用分子濃度與質量濃度時的幾種地高辛代謝產物的交叉反應率,結果發現二者有較大的差別,從而證明應以物質的分子濃度表示交叉反應率的重要性。
  2)提高抗體特異性的方法:抗體的特異性是標志抗體優劣的重要指標。為提高抗體的特異性可用下列方法制備抗體。
  用抗原的某些特異性分子片段免疫動物,這樣得到的抗體較用全分子免疫動物得到的抗體特異性強。如用hCG的β亞單位免疫動物可得到對hCG高特異性的抗體。但用這種方法由于使用的抗原分子較小,所以抗體的產生比較困難。
  用親和層析方法進一步純化。這種方法費時費力,而且收獲率也較低,所以因成本高而比較少用。
  用單克隆抗體代替抗血清,但單克隆抗體的反應強度不如抗血清,而且單克隆抗體所識別的抗原濃度與多克隆抗體(抗血清)所識別的抗原濃度也不完全相同。Yalow指出,由于在標記免疫分析中所使用的是充分稀釋的抗血清,所以僅一小部分具有最高反應能力的抗體與抗原結合。因此,非均一抗體有可能提供比單克隆抗體更高的靈敏度。而單克隆抗體可提供更高的特異性。因而在選擇應用的抗體時,應根據對實驗系統的要求而定。如要求實驗系統有高度的特異性,單克隆抗體較多克隆抗體好;如對特異性的要求不很高,而要求有較高的反應強度和靈敏度,則多克隆抗體有其一定的優越性。
  3) 抗體純度鑒定
  抗體的純度鑒定可采用區帶電泳的方法。若只出現一條蛋白區帶說明抗體純化已達到要求。
  4) 抗體親和力鑒定
  抗體的親和力(affinity)是指抗原與抗體結合的牢固程度。親和力越大表示抗體的結合反應越快,抗原抗體復合物越不易解離。親和力的大小是由分子的大小、抗體結合的位點、以及抗原決定簇之間的立體構型的適合程度決定的。親和力決定實驗方法的靈敏度。因此,親和力是評價抗體質量的重要指標。
  抗體親和力的大小以親和常數表示,親和常數就是表示抗血清中抗體分子的濃度。可用飽和曲線法進行計算。
  飽和曲線法 飽和曲線法是用米氏公式計算親和常數。以結合部分(B)為縱坐標,抗原濃度(M / L)為橫坐標作圖,為一條飽和曲線。取定量的一定稀釋度的抗體,分別加入逐漸增加的抗原里,可使抗體的結合達到飽和,求出抗體飽和程度為50%時的游離抗原濃度,其倒數即為該抗體在此稀釋度下的親和常數。分別列出測定物的濃度、結合率、標記物和標準品的化學總量、標準物的總濃度(M / L)以及它的結合濃度(B, M / L),然后作圖求出F(50%飽和)的濃度,其倒數即為親和常數(K)。
  K = [AgAb] / [Ag][Ab], [AgAb] = B [Ab] = F
  當B / F = 1時,則 K = 1 / [Ag] = 1 / F (50%飽和)
  親和常數K的單位及其意義:親和常數K的單位是L / M,其意義是1克分子抗體需要稀釋多少升能夠達到50%的結合率。親和常數越大,稀釋的倍數越高,所用的抗體量越小。

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