感受態(tài)細(xì)胞制備過程中應(yīng)注意的問題
日期:2009-08-12 15:55:07
1 細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài):實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度,盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(一般通過檢測(cè)OD600來控制。DH5?菌株OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是5×107/ml);
2 所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行;
3 經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞,在低溫條件下,一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加,24小時(shí)達(dá)到最高,之后轉(zhuǎn)化率再下降(這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的);
4 化合物及無機(jī)離子的影響:在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子(如Mn2+或Co2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高(100-1000倍);
5 所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率;
6 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響:用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA;
7 一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比;






