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感受態(tài)細(xì)胞制備過程中應(yīng)注意的問題

日期:2009-08-12 15:55:07


1   細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài):實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度,盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(一般通過檢測(cè)OD600來控制。DH5?菌株OD6000.5時(shí)細(xì)胞密度是5×107/ml);

2   所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行;

3   經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞,在低溫條件下,一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加,24小時(shí)達(dá)到最高,之后轉(zhuǎn)化率再下降(這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的);

4   化合物及無機(jī)離子的影響:在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子(如Mn2+Co2+)、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,可使轉(zhuǎn)化效率大大提高(100-1000倍);

5   所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率;

6  質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響:用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA

7  一定范圍內(nèi),轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比;