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標簽內參抗體與目標蛋白抗體進行共檢測時,需注意哪些實驗條件?

日期:2025-11-20 14:34:34

    共檢測的關鍵是避免抗體交叉干擾、保證兩者充分結合,實驗條件需圍繞“抗體兼容性、孵育順序、信號區分”三大核心把控。
 
一、抗體選擇的核心注意事項
    種屬來源無交叉:目標蛋白抗體與標簽內參抗體需來自不同種屬,比如目標抗體用兔抗,內參抗體用鼠抗,避免二抗交叉識別。
    抗體類型匹配:優先選擇單克隆抗體,特異性更強,減少非特異性結合;若用多克隆抗體,需提前驗證無交叉反應。
    標簽與目標蛋白無干擾:確保標簽內參(如GAPDH、β-actin)與目標蛋白的分子量差異明顯(通常≥5kDa),避免電泳分離時重疊。
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二、孵育順序的優化選擇
    同步孵育(推薦優先嘗試):將目標蛋白抗體和標簽內參抗體按比例混合,同時加入膜上或樣本中孵育。
    適用場景:兩種抗體種屬不同、無交叉反應,可節省實驗時間。
關鍵要點:抗體濃度需適當降低(比單獨孵育低30%-50%),避免抗原結合位點競爭。
    分步孵育(適合抗體兼容性未知時):先孵育目標蛋白抗體,洗膜后再孵育標簽內參抗體。
    適用場景:目標蛋白表達量低,需優先保證其結合;或懷疑抗體可能存在輕微交叉。
關鍵要點:第一步孵育的抗體需充分洗滌(3次×5分鐘),避免殘留影響后續結合。
 
三、其他關鍵實驗條件控制
    二抗選擇:使用針對兩種抗體種屬的混合二抗(如羊抗兔+羊抗鼠),或分別標記不同熒光基團的二抗(適用于熒光檢測),確保信號可區分。
    孵育溫度與時間:同步孵育建議4℃過夜,分步孵育可室溫1小時+4℃過夜,保證抗體充分結合。
    洗滌條件:每次孵育后用含0.1%Tween-20的TBST充分洗滌,減少非特異性背景,避免抗體殘留導致的信號干擾。
    信號檢測:若為化學發光檢測,需確保兩種抗體對應的信號強度匹配(可通過調整二抗濃度實現),避免強信號掩蓋弱信號。