抗體表達量檢測方法有哪幾種?
日期：2026-02-06 15:37:17
抗體表達量的檢測方法可根據檢測層面（細胞內 / 上清液）、檢測原理（免疫結合 / 理化分析 / 生物學活性）和檢測通量（定性 / 定量、低通量 / 高通量）分類，核心分為直接定量法、免疫結合法、生物學活性法三大類，還有適配不同研究階段的輔助檢測方法，不同方法的靈敏度、操作難度、適用場景差異顯著，以下是主流方法的詳細梳理，含原理、優勢、局限性和適用場景：
（2）夾心 ELISA
（2）免疫比濁法
3、滴度測定（如雜交瘤腹水滴度）
一、直接理化定量法（測總蛋白量，無特異性）
直接檢測樣品中總蛋白濃度，若樣品為高純度抗體（如純化后的單抗），可直接代表抗體表達量，是純化后抗體定量的金標準，無法區分抗體與雜蛋白。
1、紫外吸收法（A280 法）
原理：抗體的色氨酸、酪氨酸在 280nm 處有特征紫外吸收，根據吸光度值結合公式計算濃度（IgG：1 A280≈1.43 mg/mL，可根據抗體亞型調整系數）。
優勢：快速、無損、無需試劑，可直接檢測上清 / 純化樣品，適合快速初篩。
局限：樣品純度需＞90%，低純度樣品（如細胞裂解液）易受雜蛋白干擾。
適用：純化后抗體的快速定量、發酵上清的粗定量。
2、BCA 法 / 考馬斯亮藍法（Bradford法）
原理：利用蛋白與染料的顯色反應，吸光度與蛋白濃度成正比，通過標準曲線定量。
優勢：靈敏度高（BCA：μg/mL 級，Bradford：ng/mL 級），操作簡單，適合低濃度樣品。
局限：無特異性，需樣品初步純化；Bradford 法受去污劑干擾大。
適用：細胞裂解液中總抗體的粗定量、純化抗體的精準定量（補充A280法）。
二、免疫結合定量法（測特異性抗體）
利用抗原 - 抗體的特異性結合，通過標記物（酶、熒光、同位素）放大信號，定量檢測樣品中的特異性抗體，可區分目標抗體與雜蛋白，是未純化樣品（細胞上清 / 裂解液）抗體表達量檢測的主流方法，靈敏度覆蓋 ng/mL~pg/mL 級。
1、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）—— 實驗室常規定量首選
（1）間接ELISA
原理：包被抗原→結合樣品中的目標抗體→加酶標二抗（抗抗體）→加底物顯色，吸光度與抗體濃度成正比。
優勢：特異性高、靈敏度高（ng/mL 級）、操作簡單、通量高（96/384 孔板）、成本低。
局限：需純化抗原，無法區分抗體的構象（折疊正確 / 錯誤）。
適用：細胞培養上清、雜交瘤腹水、血清中特異性抗體的常規定量，高通量篩選高表達株。
（2）夾心 ELISA
原理：包被捕獲抗體（抗抗體恒定區，如抗 IgG Fc 段）→結合樣品中的目標抗體→加酶標檢測抗原→顯色定量，無需目標抗體的特異性抗原。
優勢：無需純化的特異性抗原，僅需抗 Fc 段抗體，適合抗原難以純化的抗體定量。
局限：靈敏度略低于間接 ELISA，需匹配抗體亞型的捕獲 / 檢測試劑。
適用：新型抗體（如雙抗、融合抗體）、抗原難制備的抗體的定量。
2、免疫印跡法（WB/Western Blot）—— 定性 + 半定量
原理：樣品經 SDS-PAGE 分離→轉膜→加一抗（抗目標抗體）/ 二抗（酶標）→顯色，通過條帶灰度值與標準曲線對比實現半定量。
優勢：可同時驗證抗體的分子量和表達量，排除雜蛋白干擾，適合確認抗體是否正確表達。
局限：半定量（精度低于 ELISA）、通量低、操作繁瑣。
適用：抗體表達的定性驗證、低通量樣品的半定量、排查抗體降解 / 錯配問題。
3、流式細胞術（FCM）—— 細胞表面抗體 / 胞內抗體的原位定量
原理：對表達抗體的細胞（如雜交瘤、穩轉細胞）進行熒光標記（抗抗體熒光二抗），通過流式檢測細胞的熒光強度，熒光值與細胞內 / 表面的抗體表達量成正比，可單細水平定量。
優勢：原位檢測、單細分辨率、可同時分析細胞活率 / 表型，適合細胞株篩選。
局限：需制備單細胞懸液，無法檢測上清中的分泌型抗體。
適用：雜交瘤細胞、穩轉細胞的高表達株高通量篩選，細胞表面抗體（如抗體藥物偶聯物 ADC）的表達定量。
4、其他免疫定量法
（1）化學發光免疫分析（CLIA）
原理：與 ELISA 類似，以化學發光底物替代酶促顯色，信號更強、靈敏度更高（pg/mL 級）。
適用：低濃度抗體樣品（如微量上清、血清）的超敏定量，臨床樣本檢測。
（2）免疫比濁法
原理：抗體與抗原結合形成免疫復合物，使溶液濁度增加，濁度與抗體濃度成正比。
優勢：快速、自動化程度高，適合大批量樣品檢測。
適用：臨床血清中抗體的常規檢測，工業大規模發酵的快速質控。
三、生物學活性法（測功能活性抗體，最貼合實際應用）
抗體的核心價值是生物學活性（如中和抗原、結合受體、補體依賴的細胞毒性 ADCC 等），該類方法通過檢測抗體的功能活性間接定量，反映的是折疊正確、具有生物活性的抗體含量，而非總抗體量，是抗體藥物研發的關鍵檢測方法（僅活性抗體有藥用價值）。
（1）中和試驗
原理：抗體與病毒 / 毒素 / 細胞因子結合，抑制其生物活性，通過檢測靶細胞的存活 / 病變程度，定量中和活性抗體的濃度（如 ED50、IC50）。
優勢：直接反映抗體的核心功能，貼合臨床應用。
局限：操作復雜、耗時長、通量低，需活細胞 / 病毒模型。
適用：中和抗體（如抗病毒、抗毒素抗體）的活性定量與篩選。
（2）結合活性試驗（SPR/BLI）
原理：利用表面等離子體共振（SPR）/生物層干涉技術（BLI），實時檢測抗體與抗原的結合動力學（Ka、Kd、KD），同時可通過結合信號定量抗體濃度。
優勢：無標記、實時檢測、可同時測結合活性和表達量，精準反映抗體的構象完整性。
局限：儀器昂貴（SPR：百萬級）、操作要求高，適合少量樣品的精準分析。
適用：抗體藥物的活性質控、高親和力抗體的篩選、結合動力學研究。
（3）細胞介導的活性試驗（ADCC/CDC 試驗）
原理：檢測抗體介導的抗體依賴的細胞毒性（ADCC）/補體依賴的細胞毒性（CDC），通過靶細胞的裂解程度定量活性抗體。
優勢：直接反映抗體的效應功能，貼合抗體藥物的體內作用機制。
局限：操作復雜、重復性要求高，需效應細胞 / 補體。
適用：抗腫瘤、抗免疫性疾病抗體藥物的活性定量。
四、輔助檢測方法（適配抗體表達的初篩 / 高通量篩選）
這類方法以定性 / 半定量為主，快速、低成本，適合抗體表達的初步篩選，快速淘汰低表達株，減少后續定量工作的工作量。
1、免疫熒光染色（IF/ICC）
原理：對表達抗體的細胞進行熒光標記，通過熒光顯微鏡 / 共聚焦觀察熒光強度，半定量判斷抗體表達量。
適用：細胞內抗體表達的初篩，快速判斷細胞是否表達目標抗體。
2、斑點雜交（Dot Blot）
原理：將樣品直接點在膜上，無需電泳，通過免疫結合顯色，半定量判斷抗體表達量。
優勢：比 WB 更快速、通量更高，適合大量樣品的初篩。
適用：雜交瘤細胞上清、穩轉細胞上清的高通量初篩。
3、滴度測定（如雜交瘤腹水滴度）
原理：將樣品倍比稀釋，通過 ELISA / 中和試驗檢測最高陽性稀釋度，反映抗體的相對表達量。
優勢：快速、低成本，適合初步評估表達水平。
適用：雜交瘤細胞的初篩，快速判斷高滴度株。
五、不同研究階段的方法選擇指南
| 研究階段 | 檢測目標 | 首選方法 | 輔助方法 |
| 抗體表達初篩 | 快速判斷是否表達 / 低通量 | 免疫熒光、Dot Blot、WB | 紫外吸收法（粗定量） |
| 高表達株篩選 | 高通量、特異性定量 | ELISA、流式細胞術 | 滴度測定 |
| 純化后抗體定量 | 精準、無損總蛋白定量 | 紫外吸收法（A280）+BCA | 免疫比濁法 |
| 抗體活性驗證 | 功能活性抗體定量 | ELISA（結合活性）+SPR | 中和試驗、ADCC/CDC 試驗 |
| 臨床 / 工業質控 | 超敏、精準、自動化 | CLIA、免疫比濁法、SPR | BCA 法（補充） |
六、核心方法對比（靈敏度 + 特異性 + 操作難度）
| 方法 | 靈敏度 | 特異性 | 操作難度 | 定量類型 |
| 紫外吸收法 | mg/mL級 | 無 | 易 | 絕對定量 |
| ELISA | ng/mL級 | 高 | 中 | 絕對定量 |
| CLIA | pg/mL級 | 高 | 中 | 絕對定量 |
| 流式細胞術 | 單細水平 | 高 | 中 | 相對定量 |
| WB | ng/mL級 | 高 | 難 | 半定量 |
| SPR/BLI | ng/mL級 | 高 | 難 | 絕對定量 |
| 中和試驗 | 活性單位 | 極高 | 極難 | 相對定量 |
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