流式細胞實驗細胞熒光染色步驟
日期：2026-02-11 11:24:59
流式細胞術中的細胞熒光染色是檢測細胞表面或胞內特定分子表達水平的關鍵步驟。根據(jù)目標分子的位置（膜表面或胞內），染色流程略有不同。以下是常規(guī)的細胞熒光染色基本步驟，不使用表格形式描述：
一、實驗前準備
1、細胞樣本制備：
從培養(yǎng)細胞、外周血、組織或動物模型中獲取單細胞懸液。確保細胞活性良好（通常要求活率 >90%），濃度適中（一般為 1×10? 細胞/mL 左右）。
2、抗體選擇與配制：
根據(jù)實驗目的選擇特異性熒光標記的一抗（如 FITC、PE、APC 等偶聯(lián)抗體）。避免熒光光譜重疊，合理搭配多色組合。抗體需用流式專用緩沖液（如 PBS + 1–2% FBS 或 BSA）稀釋至推薦工作濃度。
3、準備試劑與耗材：
包括流式緩沖液（PBS 含 1–2% 胎牛血清或 BSA，0.1% NaN?）、固定/破膜試劑（如需胞內染色）、離心管、冰盒等。全程建議在 4°C 操作以減少非特異性結合和抗原內化。
二、細胞表面染色步驟（適用于膜蛋白）
1、細胞計數(shù)與分裝：
取適量細胞（通常每管 0.5–1×10? 個）于 1.5 mL 流式管中，1500 rpm（約 300–400 ×g）離心 5 分鐘，棄上清。
2、抗體孵育：
用 50–100 μL 預冷的流式緩沖液重懸細胞沉淀，加入適量熒光標記抗體，輕柔混勻。避光，4°C 孵育 20–30 分鐘。
3、洗滌：
加入 1–2 mL 流式緩沖液，再次離心（同上條件），棄上清以去除未結合抗體。
4、重懸與過濾：
用 200–500 μL 流式緩沖液重懸細胞，必要時通過 35–70 μm 尼龍濾網(wǎng)過濾，防止堵塞流式儀噴嘴。
5、上機檢測：
盡快上機分析（通常 4°C 保存并在 24 小時內完成），避免熒光淬滅或細胞死亡。
三、胞內染色步驟（適用于細胞因子、轉錄因子、磷酸化蛋白等）
1、先進行表面染色（可選）：
若需同時檢測表面標志物，按上述表面染色流程先完成膜染色并洗滌。
2、固定細胞：
加入適量預冷的固定劑（如 4% 多聚甲醛或商業(yè)固定液），室溫避光孵育 10–20 分鐘，使蛋白質交聯(lián)、細胞結構穩(wěn)定。
3、破膜處理：
離心棄固定液，用破膜緩沖液（含皂苷或 Triton X-100 的專用試劑）重懸細胞。破膜液需全程使用（包括后續(xù)抗體稀釋和洗滌），以維持胞內通透性。
4、胞內抗體孵育：
在破膜緩沖液中加入熒光標記的胞內抗體，4°C 避光孵育 30–60 分鐘。
5、洗滌與重懸：
用破膜緩沖液洗滌一次，再用普通流式緩沖液洗去破膜劑（若儀器兼容），最后用流式緩沖液重懸細胞。
6、上機分析：
同樣需盡快檢測，注意某些固定/破膜處理可能影響前向/側向散射信號。
四、注意事項
所有操作盡量避光，防止熒光淬滅。
設置充分對照：包括未染色對照、單染對照（用于補償調節(jié)）、同型對照（評估非特異性結合）及FMO對照（熒光減一對照，用于多色設門）。
抗體用量需優(yōu)化，過高導致非特異信號，過低則信號弱。
對于活細胞功能染色（如鈣流、活性氧），需采用非固定方案，并在染色后立即上機。
通過規(guī)范的熒光染色流程，可獲得高信噪比、可重復的流式細胞數(shù)據(jù)，為免疫表型、信號通路或細胞功能研究提供可靠依據(jù)。
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