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酵母雙雜交自激活驗證的實驗步驟

日期:2023-08-21 16:47:33

    酵母雙雜交(Yeast Two-Hybrid)是常用的蛋白質相互作用的實驗技術。在進行雙雜交自激活驗證實驗時,可以按照以下步驟進行操作:

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實驗前準備
 
    準備兩個酵母菌株:一個是用于檢測蛋白質自激活的菌株(例如AH109),另一個是作為質粒攜帶者和報告基因表達的菌株(例如Y187)。
 
    構建融合蛋白質的載體:將待檢測蛋白的編碼序列克隆到適當的雙雜交載體中,通常包括激活區域(AD)和DNA結合區域(BD)。
 
    驗證載體的無毒性:通過轉化含有空載體的菌株來驗證載體本身不會導致菌株生長異常。


 
轉化酵母菌株
 
    將質粒攜帶者(例如Y187)和融合蛋白質的載體(例如AH109)分別線性化,然后通過化學方法或電擊法將線性化DNA轉化到相應的酵母菌株中。
 
    進行選擇培養:將轉化后的酵母菌分別移植到含有選擇性培養基的平板上,以篩選出具有正確載體的菌落。


 
進行交互檢測
 
    鑒定陽性相互作用:將篩選得到的陽性菌落分別提取DNA,進行PCR擴增和序列分析,確認融合蛋白質的正確定序。
 
    進行雙雜交驗證:將陽性菌株分別轉化到兩個不同的抗性選擇培養基中(例如TDO和QDO培養基),觀察是否出現報告基因(如 HIS3、Ade2和LacZ)表達的現象。
設置對照組:設置空載體對照和已知相互作用的陽性對照,以確保實驗結果的準確性。


 
結果分析
 
    觀察菌落生長情況:在選擇培養基上觀察菌落生長,陽性菌株應在TDO和QDO培養基上能夠生長。
 
    檢測報告基因表達:使用相應的檢測方法(如X-gal染色、HIS3和Ade2的活性檢測)來測試報告基因的表達水平,以確認蛋白質的相互作用。
 
    以上步驟僅概述了雙雜交自激活驗證的基本流程,具體的實驗操作和條件可能因實驗目的和試劑盒等不同而有所差異。在進行實驗前,請仔細閱讀相關文獻和試劑盒的說明,并按照其中提供的操作指南進行實驗。