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RNA pull down實驗后,富集到的蛋白或核酸如何進行下游分析?

日期:2025-12-31 14:33:51

1、富集蛋白的下游分析
    Western Blot(WB):先將洗脫蛋白經SDS-PAGE分離并轉膜,用目標蛋白抗體孵育后以ECL顯影,通過與輸入對照、陰性對照比較信號強度,半定量驗證已知互作蛋白的特異性結合。
    質譜分析(MS):對洗脫蛋白進行膠內酶解或溶液酶解,經LC-MS/MS檢測后搜庫鑒定蛋白種類,并結合GO、KEGG注釋與互作網絡分析,篩選潛在功能相關蛋白。
    SDS-PAGE預篩:通過銀染或考馬斯亮藍染色快速觀察富集蛋白的條帶分布,初步判斷是否有特異性富集。
 
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2、富集核酸的下游分析
    qPCR/RT-qPCR:提取復合物中的RNA并去除DNA污染,逆轉錄后進行定量擴增,比較實驗組與對照組的Ct值,評估RNA結合的特異性與相對豐度。
    高通量測序(RNA-seq):構建cDNA文庫并測序,通過生物信息學分析全基因組范圍內與目標RNA相互作用的RNA分子,挖掘潛在調控網絡。
 
3、試劑盒廠家的下游技術支持
    主流廠家普遍提供多維度支持:
    方法學指導:針對WB、MS、qPCR等下游檢測提供優化方案,包括樣本制備、試劑選擇與對照設計。
    實驗服務:部分廠家可承接富集樣本的質譜鑒定、WB檢測或測序服務,并提供完整結果分析報告。
    問題排查:通過技術熱線或郵件解答背景高、信號弱等常見問題,協助優化實驗流程。
    數據解讀:對質譜或測序原始數據進行注釋與功能分析,幫助研究者快速定位關鍵互作分子。