重組GST融合蛋白的表達和純化實驗步驟

日期：2026-02-10 13:42:35

重組GST（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）融合蛋白的表達與純化是一種廣泛應(yīng)用的蛋白制備策略，主要利用GST標簽與谷胱甘肽（GSH）的高親和力進行親和純化。以下是該實驗的標準操作流程，不使用表格形式：

1. 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

首先將目標基因克隆至含GST標簽的原核表達載體（如pGEX系列），確保讀碼框正確且?guī)в泻线m的啟動子（通常為tac或lacUV5）和篩選標記（如氨芐青霉素抗性）。構(gòu)建驗證無誤后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達宿主菌（常用BL21(DE3)或其衍生菌株）。

2. 小量誘導(dǎo)表達測試

挑取單克隆接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1:50–1:100比例轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD???約為0.6–0.8。加入IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至終濃度0.1–1.0 mM，誘導(dǎo)表達4–6小時（或16–18小時低溫誘導(dǎo)，如16℃、0.1 mM IPTG，以提高可溶性）。取樣進行SDS-PAGE分析，確認目標蛋白表達水平及可溶性。

3. 大量表達

根據(jù)小試結(jié)果，擴大培養(yǎng)體積（如500 mL–2 L），同步進行誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃下5000–6000 ×g離心10–15分鐘收集菌體，棄上清，菌體可立即處理或于–80℃凍存?zhèn)溆谩?/span>

4. 菌體裂解

將菌體重懸于預(yù)冷的PBS或?qū)Ｓ昧呀饩彌_液（通常含50 mM Tris-HCl pH 7.4–8.0、150 mM NaCl、1 mM EDTA，并添加蛋白酶抑制劑如PMSF），冰浴條件下采用超聲破碎（如工作2秒/間歇3秒，總時間5–10分鐘）或高壓均質(zhì)法裂解細胞。裂解后4℃下12,000–15,000 ×g離心20–30分鐘，分離上清（可溶性組分）與沉淀（包涵體）。

5. GST親和層析純化

將上清緩慢上樣至預(yù)先用結(jié)合緩沖液平衡好的谷胱甘肽瓊脂糖樹脂（Glutathione Sepharose）柱。GST融合蛋白特異性結(jié)合于樹脂，雜質(zhì)被洗脫。用10–15倍柱體積的洗滌緩沖液（成分同裂解緩沖液）充分清洗非特異性結(jié)合蛋白。

6. 目標蛋白洗脫

使用含10–20 mM還原型谷胱甘肽的洗脫緩沖液（如50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、10–20 mM GSH）進行梯度或分步洗脫，收集含目標蛋白的洗脫峰。洗脫液通常呈黃色（因GSH顏色）。

7. 緩沖液置換與濃縮

若需去除谷胱甘肽或更換儲存緩沖液，可通過透析、超濾離心管或凝膠過濾層析進行緩沖液置換。必要時使用超濾裝置濃縮蛋白至所需濃度。

8. 質(zhì)量檢測與保存

通過SDS-PAGE評估純度，Bradford或BCA法測定蛋白濃度。如需長期保存，可分裝后于–80℃凍存，或加入50%甘油于–20℃保存。部分應(yīng)用可能需切除GST標簽（如使用PreScission Protease等位點特異性蛋白酶），此步驟可在純化前后進行，視實驗需求而定。

整個流程強調(diào)低溫操作、防止蛋白降解，并根據(jù)目標蛋白特性優(yōu)化誘導(dǎo)條件與裂解方法，以獲得高產(chǎn)量、高純度且具有功能活性的GST融合蛋白。