大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的哪些措施可減少包涵體的產(chǎn)生？?

日期：2025-11-24 14:45:02

大腸桿菌表達系統(tǒng)中，蛋白形成包涵體的核心原因是蛋白表達速率過快、折疊能力不足、二硫鍵錯配或疏水性相互作用導(dǎo)致聚集，本質(zhì)是“蛋白合成與折疊的失衡”。減少包涵體的核心思路是減慢表達速率、優(yōu)化折疊環(huán)境、增強可溶性輔助機制，具體可從“表達系統(tǒng)設(shè)計、培養(yǎng)條件優(yōu)化、蛋白結(jié)構(gòu)改造、輔助因子添加”四個維度入手，措施如下：

一、優(yōu)化表達系統(tǒng)：從源頭降低蛋白聚集風險

通過調(diào)整載體、啟動子、宿主菌，控制蛋白表達的“速率和質(zhì)量”，避免過量未折疊蛋白積累。

1、選擇弱/可控啟動子，避免強啟動子導(dǎo)致的過量表達：

強啟動子（如T7、T5）會使蛋白快速大量合成，超出大腸桿菌的折疊能力，優(yōu)先選擇弱啟動子（如lac、araBAD、trc），或可控啟動子（如IPTG誘導(dǎo)的lacUV5、阿拉伯糖誘導(dǎo)的araBAD），通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間，精準控制表達速率。

示例：用araBAD啟動子替代T7啟動子，通過阿拉伯糖濃度（0.001%-0.2%）調(diào)控表達強度，減少包涵體。

2、選擇合適的宿主菌，增強折疊/可溶性能力：

普通宿主菌（如BL21(DE3)）適合表達簡單蛋白，若表達復(fù)雜蛋白（如含多個二硫鍵、跨膜區(qū)），優(yōu)先選擇“折疊增強型宿主菌”：

含分子伴侶的宿主菌（如BL21(DE3)pLysS/pLysE，表達T7溶菌酶降低基礎(chǔ)表達；Rosetta-gami系列，同時表達DsbC/DsbA（二硫鍵異構(gòu)酶）和分子伴侶GroEL/GroES，促進二硫鍵正確形成和蛋白折疊）；

密碼子優(yōu)化型宿主菌（如Rosetta系列，補充大腸桿菌稀有密碼子對應(yīng)的tRNA，避免翻譯過程中核糖體停滯導(dǎo)致的蛋白錯誤折疊）。

3、構(gòu)建融合蛋白，提高可溶性：

將目標蛋白與“可溶性標簽”融合表達，利用標簽的親水性或折疊引導(dǎo)作用，減少聚集：

常用可溶性標簽：GST（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）、MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白，效果最優(yōu)）、SUMO（小泛素樣修飾蛋白）、Trx（硫氧還蛋白）；

原理：MBP等標簽可與目標蛋白形成穩(wěn)定的融合結(jié)構(gòu)，增強整體親水性，同時可能輔助目標蛋白正確折疊；后續(xù)可通過酶切（如SUMO酶、凝血酶）去除標簽，不影響目標蛋白活性。

二、優(yōu)化培養(yǎng)與誘導(dǎo)條件：為蛋白折疊提供適宜環(huán)境

通過調(diào)整溫度、誘導(dǎo)時機、培養(yǎng)基成分等，減慢表達速率，延長折疊時間，改善胞內(nèi)折疊環(huán)境。

1、降低培養(yǎng)溫度，減慢表達與聚集速率：

高溫（37℃）會加速蛋白合成，但也會加劇未折疊蛋白的疏水相互作用和聚集，降低溫度（16-25℃）可顯著減少包涵體：

常規(guī)方案：37℃培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8（對數(shù)中期），降溫至20-25℃誘導(dǎo)，延長誘導(dǎo)時間（8-24小時），讓蛋白有充足時間折疊；

極端情況（復(fù)雜蛋白）：16℃低溫誘導(dǎo)24-48小時，進一步降低聚集概率，但需注意菌體量和蛋白產(chǎn)量的平衡。

2、優(yōu)化誘導(dǎo)時機與誘導(dǎo)劑濃度：

誘導(dǎo)時機：選擇對數(shù)中期（OD600=0.6-1.0）誘導(dǎo)，此時菌體代謝旺盛、折疊系統(tǒng)活躍，避免對數(shù)早期（菌體弱小）或穩(wěn)定期（代謝停滯）誘導(dǎo)；

誘導(dǎo)劑濃度：IPTG誘導(dǎo)時，避免高濃度（1mM）導(dǎo)致的“爆發(fā)式表達”，采用低濃度（0.01-0.1mM）誘導(dǎo)，控制表達速率；若用araBAD啟動子，阿拉伯糖濃度控制在0.01%-0.1%即可。

3、優(yōu)化培養(yǎng)基成分，改善胞內(nèi)環(huán)境：

補充碳源和能量物質(zhì)：在培養(yǎng)基中添加葡萄糖（0.5%-1%）、甘油或山梨醇，維持菌體代謝活力，同時山梨醇可通過滲透壓應(yīng)激促進分子伴侶表達；

補充金屬離子和輔酶：若目標蛋白需金屬離子（如Zn²?、Mg²?）輔助折疊，在培養(yǎng)基中添加適量對應(yīng)金屬鹽（如0.1-1mMZnCl?）；

調(diào)節(jié)pH：用緩沖培養(yǎng)基（如TB培養(yǎng)基、MOPS緩沖培養(yǎng)基）維持pH穩(wěn)定（7.0-7.4），避免pH波動影響蛋白折疊。

4、添加化學佐劑，抑制聚集并促進折疊：

滲透壓調(diào)節(jié)劑：添加0.5-1M山梨醇、0.1-0.2M甘氨酸甜菜堿，通過滲透壓應(yīng)激誘導(dǎo)大腸桿菌表達分子伴侶（如GroEL/GroES），同時減少蛋白聚集；

氧化還原調(diào)節(jié)劑：若蛋白含二硫鍵，在培養(yǎng)基中添加還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）（比例10:1或5:1），維持胞內(nèi)氧化還原平衡，促進正確二硫鍵形成；

折疊促進劑：添加低濃度變性劑（如0.5%-1%甘油、0.05%-0.1%TritonX-100）或脯氨酸（0.2-1M），抑制蛋白疏水區(qū)域相互作用，減少聚集。

三、改造目標蛋白結(jié)構(gòu)：增強自身可溶性

通過基因工程修飾蛋白序列，降低其疏水性或易錯折疊區(qū)域，從根本上減少聚集傾向（需結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)信息）。

1、刪除或替換疏水性強的區(qū)域：

分析蛋白序列，若存在連續(xù)疏水性氨基酸殘基（如跨膜區(qū)、信號肽殘留），可通過定點突變替換為親水性殘基（如Asp、Glu、Ser），或刪除該區(qū)域（需確保不影響蛋白功能）；

示例：將蛋白N端疏水信號肽刪除，避免信號肽未切割導(dǎo)致的聚集。

2、優(yōu)化二硫鍵形成位點：

若蛋白含多個二硫鍵，可通過定點突變增加或調(diào)整半胱氨酸殘基位置，避免二硫鍵錯配；或在蛋白序列中引入大腸桿菌二硫鍵異構(gòu)酶（DsbA/DsbC）的識別序列，促進正確二硫鍵形成。

3、增加親水性標簽或linker：

在蛋白N端或C端添加短親水性肽段（如6×His標簽、多聚Ser/Thr序列），增強整體親水性；

若為融合蛋白，在目標蛋白與標簽之間插入柔性linker（如(Gly4Ser)3），避免標簽與目標蛋白空間位阻導(dǎo)致的折疊異常。

四、其他輔助措施：進一步降低包涵體概率

1、縮短培養(yǎng)周期，避免蛋白過度積累：

誘導(dǎo)后及時收獲菌體（如20℃誘導(dǎo)8-12小時，而非24小時以上），避免目標蛋白在胞內(nèi)長時間停留導(dǎo)致聚集。

2、優(yōu)化蛋白表達定位：

若胞內(nèi)表達易形成包涵體，可構(gòu)建分泌型表達載體（如添加信號肽OmpA、PelB），將蛋白分泌到周質(zhì)空間或培養(yǎng)基中；周質(zhì)空間氧化環(huán)境更利于二硫鍵形成，且蛋白濃度較低，聚集風險降低。

3、共表達分子伴侶或折疊酶：

構(gòu)建雙表達載體，同時表達目標蛋白與分子伴侶（GroEL/GroES、DnaK/DnaJ/GrpE）或二硫鍵異構(gòu)酶（DsbA/DsbC），直接增強大腸桿菌的折疊能力；

常用組合：GroEL/GroES+DsbC，適用于復(fù)雜蛋白（含二硫鍵且折疊難度高）。

4、關(guān)鍵實施原則與優(yōu)先級

優(yōu)先級排序：優(yōu)先采用“低成本、易操作”的措施（如降低溫度、調(diào)整誘導(dǎo)劑濃度、更換宿主菌），再嘗試“融合標簽”或“共表達分子伴侶”，最后考慮“蛋白結(jié)構(gòu)改造”（耗時較長）；

5、針對性選擇：

簡單蛋白（無跨膜區(qū)、無二硫鍵）：優(yōu)先降低溫度+弱啟動子，即可減少包涵體；

復(fù)雜蛋白（多二硫鍵、跨膜區(qū)）：選擇Rosetta-gami宿主菌+MBP融合+低濃度誘導(dǎo)+氧化還原調(diào)節(jié)劑；

避免過度優(yōu)化：部分措施（如高濃度山梨醇、過長誘導(dǎo)時間）可能影響菌體生長和蛋白產(chǎn)量，需通過梯度實驗平衡“可溶性”與“產(chǎn)量”（如測試0.05mM、0.1mM、0.5mMIPTG濃度，選擇可溶性最高且產(chǎn)量可接受的條件）。

減少大腸桿菌表達系統(tǒng)中包涵體的核心是“控速率、優(yōu)環(huán)境、強折疊”：通過弱啟動子、低濃度誘導(dǎo)、低溫培養(yǎng)控制表達速率，通過優(yōu)化培養(yǎng)基、添加佐劑改善折疊環(huán)境，通過融合標簽、共表達分子伴侶增強折疊能力，再結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)改造（復(fù)雜情況），可顯著提高目標蛋白的可溶性。實際應(yīng)用中需根據(jù)蛋白特性（如結(jié)構(gòu)、二硫鍵數(shù)量、疏水性）針對性組合措施，無需盲目嘗試所有方法。