大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白常形成包涵體，哪些措施可減少包涵體的產(chǎn)生？?

日期：2025-11-26 11:55:16

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中蛋白形成包涵體的核心原因是：蛋白表達(dá)速度過快、折疊滯后，導(dǎo)致疏水性氨基酸暴露并聚集，或二硫鍵錯(cuò)配、翻譯后修飾缺失引發(fā)構(gòu)象異常。減少包涵體需從“減緩表達(dá)速率、優(yōu)化折疊環(huán)境、降低聚集風(fēng)險(xiǎn)”三個(gè)核心方向入手，結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)制定針對性措施，具體如下：

一、優(yōu)化基因與載體設(shè)計(jì)（從源頭降低聚集傾向）

密碼子偏好性與GC含量優(yōu)化：將靶基因密碼子替換為大腸桿菌高頻密碼子，避免連續(xù)稀有密碼子導(dǎo)致的翻譯停滯（易形成部分折疊中間體，引發(fā)聚集）；同時(shí)將GC含量控制在50%-60%，避免過高導(dǎo)致mRNA二級結(jié)構(gòu)，確保翻譯流暢，減少不完全折疊蛋白積累。

融合可溶性標(biāo)簽：在靶蛋白N端或C端融合可溶性標(biāo)簽，通過標(biāo)簽的親水性或折疊輔助功能提升蛋白可溶性：

常用標(biāo)簽：GST（谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，增強(qiáng)親水性）、MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白，輔助靶蛋白正確折疊）、NusA（nusA基因產(chǎn)物，抑制聚集）、SUMO（小泛素相關(guān)修飾物，改善折疊效率）；

注意事項(xiàng)：標(biāo)簽位置需避開靶蛋白活性中心，若后續(xù)需去除標(biāo)簽，需在標(biāo)簽與靶蛋白間插入蛋白酶切位點(diǎn)（如凝血酶、腸激酶位點(diǎn)）。

截?cái)嗷蛲蛔兪杷畢^(qū)：通過生物信息學(xué)工具（如ProtScale）預(yù)測靶蛋白的連續(xù)疏水區(qū)（≥20個(gè)疏水氨基酸），若為非功能必需區(qū)域可直接截?cái)啵蝗魹楣δ軈^(qū)，可通過同義突變替換部分強(qiáng)疏水氨基酸（如Leu→Ser、Val→Thr），降低蛋白間疏水相互作用，減少聚集。

引入分子伴侶或折疊酶：將靶基因與大腸桿菌分子伴侶（如GroEL/GroES、DnaK/DnaJ/GrpE）或折疊酶（如二硫鍵異構(gòu)酶DsbA、脯氨酸異構(gòu)酶PpiA）共表達(dá)，輔助靶蛋白折疊為天然構(gòu)象，減少中間體聚集。

二、調(diào)控表達(dá)條件（減緩表達(dá)速率，適配折疊速度）

1、降低誘導(dǎo)強(qiáng)度，避免“爆式表達(dá)”：

誘導(dǎo)劑選擇與濃度：優(yōu)先使用IPTG的低濃度誘導(dǎo)（0.01-0.1mM，常規(guī)濃度為0.5-1mM），或使用乳糖替代IPTG（乳糖需逐步誘導(dǎo)，表達(dá)速率更溫和）；

誘導(dǎo)時(shí)機(jī)：待菌體生長至OD600=0.6-0.8（對數(shù)中期）時(shí)誘導(dǎo)，此時(shí)菌體代謝活躍，折疊系統(tǒng)（分子伴侶、折疊酶）功能完善，避免對數(shù)前期（菌體弱）或后期（代謝紊亂）誘導(dǎo)導(dǎo)致的折疊壓力。

2、降低培養(yǎng)溫度，延長折疊時(shí)間：

常規(guī)表達(dá)溫度為37℃，易因表達(dá)過快導(dǎo)致折疊滯后，可將溫度降至16-25℃，并延長誘導(dǎo)時(shí)間（從3-4小時(shí)延長至12-24小時(shí)）；

低溫的作用：減緩核糖體翻譯速度，給蛋白足夠時(shí)間折疊；降低蛋白分子運(yùn)動速率，減少疏水區(qū)暴露引發(fā)的聚集；同時(shí)抑制蛋白酶活性，減少靶蛋白降解（降解片段易聚集形成包涵體）。

3、優(yōu)化培養(yǎng)基成分，改善胞內(nèi)環(huán)境：

加入折疊輔助劑：在培養(yǎng)基中添加1%-5%甘油（增加胞內(nèi)滲透壓，穩(wěn)定蛋白構(gòu)象）、0.5-1M山梨醇（緩解滲透壓壓力）、0.1-1mM還原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）（調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境，促進(jìn)二硫鍵正確形成）；

補(bǔ)充營養(yǎng)成分：使用LB培養(yǎng)基時(shí)，添加酵母提取物（增加氨基酸、維生素供應(yīng)）或酪蛋白水解物（提供小分子肽，減輕菌體代謝負(fù)擔(dān)），避免因營養(yǎng)匱乏導(dǎo)致的折疊系統(tǒng)功能下降。

三、調(diào)整表達(dá)定位，減少胞內(nèi)聚集壓力

引導(dǎo)蛋白分泌至胞外：在靶蛋白N端添加大腸桿菌分泌型信號肽（如OmpA、PhoA、PelB信號肽），引導(dǎo)蛋白分泌到周質(zhì)空間或培養(yǎng)基中，避免胞內(nèi)高濃度下的聚集；

優(yōu)勢：周質(zhì)空間氧化環(huán)境適宜二硫鍵形成，且蛋白酶含量低，既能減少包涵體，又能提升蛋白活性；

注意：若靶蛋白為大分子或疏水性強(qiáng)，分泌效率可能較低，需搭配優(yōu)化信號肽和培養(yǎng)基成分（如添加0.05%TritonX-100，增加膜通透性）。

靶向周質(zhì)空間表達(dá)：周質(zhì)空間體積小、成分簡單，蛋白濃度相對較低，且存在天然的折疊輔助系統(tǒng)（如Dsb家族蛋白），適合表達(dá)需二硫鍵折疊的蛋白，可顯著降低包涵體形成概率。

四、其他關(guān)鍵輔助措施

控制菌體生長速率：通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH（維持7.0-7.5）、搖床轉(zhuǎn)速（200-250rpm，保證氧氣供應(yīng)），避免菌體過度生長（OD600＞1.0）導(dǎo)致的胞內(nèi)擁擠，減少蛋白聚集。

避免蛋白過度表達(dá)：若靶蛋白本身折疊難度高，可適當(dāng)降低表達(dá)量（如縮短誘導(dǎo)時(shí)間、降低質(zhì)粒拷貝數(shù)），避免胞內(nèi)折疊系統(tǒng)“超負(fù)荷”，優(yōu)先保證已表達(dá)蛋白的正確折疊，而非追求高產(chǎn)量。

選擇合適的宿主菌：

優(yōu)先選擇折疊功能增強(qiáng)的宿主菌：如OrigamiB（缺陷型trxB和gor基因，利于胞內(nèi)二硫鍵形成）、Rosetta-gami（融合Rosetta的密碼子優(yōu)化功能和Origami的折疊優(yōu)勢）、BL21(DE3)pLysS（含T7溶菌酶基因，抑制基礎(chǔ)表達(dá)，避免誘導(dǎo)前靶蛋白泄漏表達(dá)導(dǎo)致的聚集）；

避免使用代謝旺盛但折疊能力弱的宿主菌（如BL21(DE3)原始菌株）表達(dá)難折疊蛋白。

減少包涵體的關(guān)鍵是“平衡表達(dá)速率與折疊速率”：通過低濃度誘導(dǎo)、低溫培養(yǎng)、密碼子優(yōu)化減緩表達(dá)速度，通過標(biāo)簽融合、分子伴侶共表達(dá)、氧化還原環(huán)境調(diào)控提升折疊效率，通過分泌表達(dá)降低胞內(nèi)濃度壓力。實(shí)際操作中可按“先易后難”的順序嘗試：先調(diào)整溫度和誘導(dǎo)濃度（低成本、易操作），若效果不佳再優(yōu)化標(biāo)簽或信號肽，最后考慮共表達(dá)分子伴侶或宿主菌替換，多數(shù)難表達(dá)蛋白可通過組合措施顯著降低包涵體比例。