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使用RNA pulldown試劑盒,需對RNA樣本進行哪些預處理?

日期:2025-12-15 11:29:58

    使用RNA pulldown試劑盒前,RNA樣本預處理的核心目標是獲得高純度、完整、無酶污染的RNA,具體需完成以下4步關鍵操作。

一、RNA完整性檢測
    采用瓊脂糖凝膠電泳檢測,真核生物總RNA需清晰呈現28S、18S兩條主帶,且28S條帶亮度約為18S的2倍。
    用Nanodrop或Qubit檢測RNA的完整性指數(RIN),RIN值≥8.0為合格,避免降解的RNA影響pulldown結合效率。
 
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二、RNA純度純化
    檢測RNA樣本的A260/A280比值,合格范圍為1.8–2.1,比值偏離說明存在蛋白或酚類污染。
    檢測A260/A230比值,合格范圍為2.0–2.5,比值過低提示存在鹽離子、多糖或有機溶劑殘留。
    若純度不達標,需用試劑盒配套的RNA純化柱或酚-氯仿抽提法重新純化,之后用無RNase的超純水溶解RNA。
 
三、去除DNA污染
    RNA樣本中殘留的基因組DNA會干擾后續實驗,需進行DNaseI消化。
    選擇無RNase污染的DNaseI,按說明書加入反應體系,37℃孵育15–30分鐘。
    消化完成后,需通過加熱滅活DNaseI或用純化柱去除酶,防止殘留酶降解靶RNA。
 
四、樣本濃度定量與調整
    用Qubit進行精準定量,Nanodrop定量結果可作為參考。
    根據試劑盒說明書要求,將RNA濃度調整至推薦范圍,通常為1–5μg/μL。
    預處理后的RNA需分裝保存,避免反復凍融,短期可存放于-20℃,長期需存放于-80℃。