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空白孔的吸光度值異常,會影響ELISA試劑盒的檢測結果判讀嗎??

日期:2025-12-17 09:16:33

    空白孔吸光度異常會直接影響ELISA檢測結果的判讀,其核心原因是空白孔的核心作用是“扣除背景干擾”,異常值會導致樣本真實信號的計算偏差,進而影響定性(陰/陽性)或定量結果的準確性。

一、先明確:空白孔的核心功能是什么?
    ELISA檢測中,空白孔(通常只加稀釋液、酶結合物底物,不加抗原/抗體、樣本)的作用是排除非特異性背景干擾,包括:
    稀釋液、底物本身的光吸收;
    酶標板孔壁的非特異性吸附;
    試劑間的交叉反應等。
 
    最終樣本的“有效吸光度”=樣本孔A值-空白孔A值(部分試劑盒要求用“空白孔調零”,本質是同一邏輯)。因此,空白孔A值是“基準值”,基準異常會導致所有樣本的有效信號計算錯誤。
 
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二、空白孔A值異常的兩種情況,影響各不相同
1.空白孔A值過高(最常見)
    判斷標準:通常空白孔A值>0.2(不同試劑盒有明確閾值,需以說明書為準),或顯著高于歷史正常水平。
主要影響:
    導致樣本“有效吸光度”偏低(因為減去了一個過大的基準值);
    定量檢測:標準曲線的擬合偏差,樣本濃度計算值偏低(可能將高濃度樣本誤判為低濃度);
    定性檢測:可能導致臨界值(Cut-off)計算異常,將陽性樣本誤判為陰性(假陰性)。
    常見原因:底物污染、酶結合物非特異性激活、酶標板未洗干凈、試劑變質(如底物顯色液失效)、檢測波長設置錯誤等。
 
2.空白孔A值過低(接近0或負值)
    判斷標準:空白孔A值<0.05(或為負值,排除儀器誤差后)。
主要影響:
    樣本“有效吸光度”被高估(減去了一個過小/負的基準值);
    定量檢測:樣本濃度計算值偏高(可能將低濃度樣本誤判為高濃度);
    定性檢測:可能導致假陽性(非特異性信號被誤判為特異性結合信號)。
    常見原因:空白孔未加底物、底物未充分顯色(如孵育時間不足、溫度過低)、儀器調零誤差、稀釋液本身透光性過強(罕見)。
 
三、關鍵結論:異常時能否繼續判讀?
    不建議直接用異常空白孔的結果判讀,需分情況處理:
    若空白孔A值輕微偏離(如0.21,接近說明書閾值0.2),且重復空白孔結果一致、標準曲線線性良好(R²≥0.98),可謹慎使用,但需在報告中注明“空白孔A值輕微異常,結果僅供參考”;
    若空白孔A值顯著異常(如>0.3或<0.02),或重復空白孔差異大(CV>10%),必須重新實驗:
    檢查試劑:更換底物、稀釋液,確認酶結合物未失效;
    規范操作:確保洗板充分(避免殘留酶)、孵育條件(溫度、時間)符合要求;
    校準儀器:檢查酶標儀波長、調零功能是否正常。
 
    空白孔是ELISA檢測的“背景校正基準”,其A值異常會通過“樣本有效信號=樣本孔A-空白孔A”的計算邏輯,直接導致定性假陰/假陽、定量濃度偏差。因此,檢測前需確認空白孔A值在試劑盒規定范圍內,異常時優先排查試劑、操作或儀器問題,而非強行判讀結果,否則會嚴重影響數據可靠性。